最近很多一線實(shí)驗(yàn)室的PCR人反饋：“內(nèi)標(biāo)半數(shù)不起”、“內(nèi)標(biāo)曲線Ct值偏大”、“內(nèi)標(biāo)時(shí)期時(shí)不起”......很是困擾。針對(duì)這個(gè)想象，小六依據(jù)多年實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)及異常曲線問(wèn)題處理經(jīng)驗(yàn)，與大家分享“內(nèi)標(biāo)曲線異常”的處理思路。

首先，確認(rèn)擴(kuò)增曲線分析設(shè)置是否正確

查看是否設(shè)置了合適的基線和閾值線。

其次，確認(rèn)內(nèi)標(biāo)的類型

我們知道，新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒的內(nèi)對(duì)照分為：內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)和外源性內(nèi)標(biāo)。

內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，常采用的是樣本中固有的人體細(xì)胞中的管家基因，如RNase P等人源基因，這些基因在人體各器官組織細(xì)胞中普遍存在，存在于采集的咽拭子等標(biāo)本中，因此可以檢測(cè)是否采集到了上皮細(xì)胞及整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的準(zhǔn)確性，由于人基因組和病毒提取效率存在一定差別，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)無(wú)法完全監(jiān)測(cè)提取過(guò)程中存在的問(wèn)題。

外源性內(nèi)標(biāo)，常用的是MS2噬菌體等假病毒，在臨床標(biāo)本制備前加入，然后與標(biāo)本中的靶核酸一起經(jīng)歷核酸提取過(guò)程，可以較全面地監(jiān)測(cè)從核酸提取到產(chǎn)物分析全過(guò)程的有效性。外源性內(nèi)標(biāo)不但可以監(jiān)測(cè)標(biāo)本中PCR抑制物及核酸提取中試劑的混入所致的假陰性外，而且還可以監(jiān)測(cè)因?yàn)镻CR擴(kuò)增儀孔位間溫度的不準(zhǔn)確及核酸的提取效率太低所致的假陰性。

與內(nèi)源性人源基因相比，外源性內(nèi)對(duì)照不能監(jiān)控標(biāo)本采集的質(zhì)量，需要提前制備并作為試劑盒的一個(gè)組分。

1.如果實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒為內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)

內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，為人體細(xì)胞中的管家基因，監(jiān)測(cè)的是樣本采集及提取、擴(kuò)增全過(guò)程。

內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)不起線或者Ct值偏大，考慮因素：

①標(biāo)本采集方面：

標(biāo)本是環(huán)境/物體標(biāo)本or人源標(biāo)本？

→環(huán)境/物表標(biāo)本：標(biāo)本中正常無(wú)人源性內(nèi)標(biāo)

→人源標(biāo)本：標(biāo)本中采集到的細(xì)胞數(shù)量是否足夠

②若人員標(biāo)本，除考慮采樣中細(xì)胞數(shù)量是否足夠外，還用考慮標(biāo)本提取效率和擴(kuò)增效率。

→提取效率：采用磁珠法進(jìn)行核酸提取的標(biāo)本，提取過(guò)程中會(huì)因?yàn)闃?biāo)本中干擾物質(zhì)多或者提取儀問(wèn)題導(dǎo)致提取后的核酸樣本中含有抑制物。

例如，標(biāo)本中含有較多粘液或者血液時(shí)樣本裂解不充分，或者，提取儀問(wèn)題導(dǎo)致提取后的核酸中有殘留的磁珠等，都會(huì)抑制后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。

還有可能，因?yàn)樘砑拥鞍酌窴的核酸提取體系與后續(xù)核酸擴(kuò)增的試劑之間有抑制。（這類問(wèn)題有案例，提取樣本時(shí)添加蛋白酶K后擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)不起或者Ct值偏大；待復(fù)檢時(shí)不加蛋白酶K提取樣本后擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)正常。這類情況只局限于幾家廠家的擴(kuò)增試劑，因此，實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新冠病毒核酸檢測(cè)前一定要對(duì)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。）

→擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率受八連管/96孔板和qPCR儀狀態(tài)影響。八連管/96孔板不潔凈會(huì)抑制擴(kuò)增，影響擴(kuò)增效率；qPCR儀孔間溫度不均會(huì)影響擴(kuò)增效率，或者，孔內(nèi)有灰塵等影響熒光值。

2.如果實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒為外源性內(nèi)標(biāo)

外源性內(nèi)標(biāo)，為假病毒，在樣本提取核酸前加入，然后與樣本中的靶核酸一起經(jīng)歷核酸提取過(guò)程，可以較全面地監(jiān)測(cè)從核酸提取到產(chǎn)物分析全過(guò)程的有效性。不但可以監(jiān)測(cè)樣本中PCR抑制物及核酸提取中試劑的混入所致的假陰性外，還可以監(jiān)測(cè)因?yàn)閝PCR儀擴(kuò)增孔位間溫度的不準(zhǔn)確及核酸的提取效率太低所致的假陰性。

因此，如果樣本間提取效率和擴(kuò)增效率的一致性較好，則內(nèi)標(biāo)的Ct值應(yīng)相近。

外源性內(nèi)標(biāo)不起線或者Ct值偏大，考慮因素：提取效率和擴(kuò)增效率。（與內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)分析原因一致）

附：“內(nèi)標(biāo)曲線異常”處理思路圖