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與行業里的那些膾炙人口的DNA聚合酶、RNA聚合酶等相比，蛋白酶K顯得很低調，以至于我們長期忽視了它的重要性。隨著這次新冠疫情的爆發，蛋白酶K的需求量暴增，國內外的供應量遠跟不上消耗量，大家才突然意識到蛋白酶K是如此的重要。
蛋白酶K / 是什么？
蛋白酶K(Proteinase K)，屬絲氨酸蛋白酶類，1974年，Wolfgang Ebeling等利用沉淀、離子交換層析和凝聚層析等方法在林伯氏白色念球菌的培養基中分離純化出蛋白酶K。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)為唯一碳氮源的環境中生長，即能夠消化角蛋白，因此被命名為蛋白酶K(Proteinase K)。蛋白酶K由一條肽鏈組成，包含277個氨基酸殘基，相對分子質量為28.9kDa。蛋白酶K家族包含了各種由真菌、酵母及革蘭氏陰性細菌分泌的細胞內肽酶。
蛋白酶K具有穩定的結構、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈，能優先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端連接的肽鍵。與其它的蛋白酶相比較，蛋白酶K具有高活力和高穩定性，其酶活不會被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制，且在高溫、高鹽或較高的pH等條件下，蛋白酶K仍能保持較高活性。因該酶在較廣的pH范圍(4～12.5)內及高溫(50～70℃)均有活性，在提取DNA和RNA的緩沖液中具有很高的活性，可用于質粒或基因組DNA、RNA的分離，是DNA提取的關鍵試劑。
蛋白酶 K 是現有蛋白酶中活性最高的品種，在 pH 4 到 pH 12 的條件下均有活性，反應溫度介于 0～75oC 之間。在常用濃度的 SDS、尿素或 EDTA 存在時亦很穩定。酶切割位點在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，可以用于所有蛋白質的降解。
蛋白酶K /國家標準
《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）是2018年5月1日實施的一項中華人民共和國國家標準，歸口于中國標準化研究院。《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）規定了蛋白酶K產品的術語和定義、技術要求、試驗方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸及貯存。《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）適用于生化試劑蛋白酶K產品的生產和檢測。
蛋白酶K /有什么作用？
近年來，隨著研究的深入，蛋白酶K的應用不僅僅局限在醫療診斷及科研領域。在實現規模化工業生產的前提下，蛋白酶K還可以替代作用范圍較窄的其它蛋白酶，應用于工業制革、食品加工、飼料生產、造紙等行業中。另外，蛋白酶K也可以替代傳統的可能存在污染的化學方法處理原材料，去除不必要的蛋白質雜質。蛋白酶K目前主要應用于基因診斷試劑盒、基因組 DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒中去除核酸酶和其它蛋白污染。
對于新冠病毒，核酸擴增試驗時的處理、抽提、擴增為高風險，因此擴增前需要對標本先行滅活病毒，蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采樣液的重要組分，可裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并且可以滅活病毒，讓病毒的蛋白變性，失去活性而“死掉”，不再有傳染性，提高運輸和檢測階段的安全性。
蛋白酶K能降解與核酸結合的蛋白質，促進核酸的分離，在提取高分子量核酸時有很大的優勢。蛋白酶K還常被用于RNA提取過程中RNase的抑制和降解。RNA的質量對于Northem印跡及雜交分析、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗至關重要。而RNA極不穩定、易于被廣泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶創造一個無RNase的環境、嚴格防止RNase污染是成功提取RNA的關鍵。
蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前標本的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用，以利于檢測探針的穿透，提高檢測的敏感性。
病毒外層結構一般以衣殼蛋白為主，蛋白酶K可以對病毒衣殼蛋白進行破壞，從而干擾病毒與宿主細胞的結合。在一定條件下，67.51ug/mL濃度的蛋白酶K處理lh對純水和生活污水中病毒滅活率分別達到了99.4％和49.4％，處理3h的滅活率分別是>99.9％和81.8％，滅活病毒的效果明顯。用蛋白酶K進行病毒滅活的優點是消毒劑本身無害，而且不產生有害消毒產物，所以這是一種高效環保的方法。
病毒外層結構一般以衣殼蛋白為主，蛋白酶K可以對病毒衣殼蛋白進行破壞，從而干擾病毒與宿主細胞的結合。在一定條件下，67.51ug/mL濃度的蛋白酶K處理lh對純水和生活污水中病毒滅活率分別達到了99.4％和49.4％，處理3h的滅活率分別是>99.9％和81.8％，滅活病毒的效果明顯。用蛋白酶K進行病毒滅活的優點是消毒劑本身無害，而且不產生有害消毒產物，所以這是一種高效環保的方法。
蛋白酶K能分解肉的肌纖維，結締組織的蛋白質，甚至包括彈性蛋白及膠原蛋白，使蛋白質的各級空間結構發生變化，部分肽鍵斷裂，肉料吸水膨脹，質地變嫩，滿足消費者對肉類品質的要求。
蛋白酶K /是金子總會發光！
不管是在科研領域，還是在IVD領域，核酸提取都是最為基礎的實驗，因而蛋白酶K一直都是非常重要的存在。然而過去，蛋白酶K的知名度遠不及它所發揮的作用，這其中很大一部分原因是因為蛋白酶K的供需關系非常穩定，很少有人會認為蛋白酶K的供給會是一個問題。
全球新冠肺炎感染人數不斷創新高，新冠病毒傳染性增強對疫情的防控無疑是產生更大的挑戰，對新冠核酸檢測的需求也不斷提升，蛋白酶K作為核酸檢測試劑盒中用于檢測樣本前處理的重要組分，目前市場需求也不斷加大。
在核酸提取實驗中蛋白酶K的工作濃度大約是50-200 μg/mL，一般情況下，提取一個樣本的核酸大約需要100 μg的蛋白酶K?，而在實際使用過程中，為了增加核酸提取效率，經常會將蛋白酶K加量使用。新冠病毒的核酸檢測帶來了大量的蛋白酶K需求，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，蛋白酶K一夜之間成為了重要的防疫物資。
蛋白酶K /大規模生產難點
雖然隨著疫情的發展，蛋白酶K的重要價值被人們所重視，然而尷尬的是，由于蛋白酶K的過度低調，以至于國內很少有企業涉獵過蛋白酶K的生產，當人們想建立蛋白酶K的生產工藝時，卻發現蛋白酶K是一個極其特殊的蛋白，短時間內擴大蛋白酶K的產能極具挑戰性。
表達量低
蛋白酶K能夠非特異性的降解大多數蛋白，對于表達宿主細胞造成嚴重毒性，因此蛋白酶K的表達量一般都很低。篩選高表達蛋白酶K的表達系統和菌株，一般需要較長的周期。
色素和核酸的殘留
大規模發酵，引入大量色素和宿主核酸的殘留，簡單的純化工藝很難除去這些雜質，而復雜的純化又增加了成本和降低了回收率。
不穩定性
蛋白酶K不夠穩定，自己能酶解自己，在無保護劑時，37℃很難長期穩定保存。
易沉淀
在制備蛋白酶K的凍干粉時，為了保證凍干粉中蛋白酶K的固含量較大，需要在高濃度時加入凍干保護劑，但是蛋白酶K在濃度達到20mg/mL及以上時，很容易聚集形成沉淀，這給蛋白酶K的高固含量凍干帶來很大的困難。
投入大
蛋白酶K具有很強的蛋白酶活性，能夠將實驗室的其它蛋白酶解，所以蛋白酶K需要專門的產地、儀器設備、人員來進行研發與生產。
蛋白酶K在體外診斷、藥物加工等生物醫藥領域有著不可替代的重要作用。長期以來，我國實驗室所用的蛋白酶K都是從各級代理商中買到的進口產品，下游產業嚴重依賴進口。隨著新冠疫情的全球大流行，蛋白酶K供不應求，導致國內嚴重缺貨，“卡脖子”效應明顯。為了不受制于人，降低成本，國產蛋白酶K替代進口將成必然趨勢。
