體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術審評報告
產(chǎn)品中文名稱：結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
北京市北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)康定街1號14號樓3層1室
北京市北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)康定街1號14號樓2層、北京市北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)康定街1號10號樓2層
技術審評概述
一、產(chǎn)品概述
（一）產(chǎn)品主要組成成分
本試劑盒含有TBPCR反應液、TB引物探針混合液、TB陰性質(zhì)控品、TB陽性質(zhì)控品、TB弱陽性質(zhì)控品，主要組成成分見表1。
表1試劑盒主要組成成分
本試劑盒用于體外定性檢測人福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中的結(jié)核分枝桿菌復合群核酸。
本產(chǎn)品采用PCR熒光探針技術，用于輔助結(jié)核病的病理診斷。
結(jié)核分枝桿菌（tuberclebacilli，TB）復合群主要包括結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，除田鼠分枝桿菌外，其余三種均對人致病，是結(jié)核病的病原菌，可通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應器官的結(jié)核病，以肺結(jié)核最常見。其致病作用可能與細菌在組織細胞內(nèi)頑強增殖引起炎癥反應，以及誘導機體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應性損傷有關。TB基因組中的插入序列IS6110具有特異性強，重復性好的特點，是TB檢測常用的靶基因片段。
實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備相關的生物安全防備設施及防護程序。
該產(chǎn)品檢測結(jié)果應結(jié)合患者臨床癥狀、體征、流行病學背景及其他臨床診斷結(jié)果進行綜合判斷，不得作為疾病診斷的唯一標準。
本產(chǎn)品檢測的靶基因為TB基因組中的插入序列IS6110，該序列作為靶基因具有特異性強，重復性好等特性。內(nèi)標為Her2基因，在人基因組中表達穩(wěn)定，是常見的管家基因。本產(chǎn)品采用熒光PCR技術，選取結(jié)核分枝桿菌基因組中相對保守的區(qū)域，設計特異性引物及探針，在樣本提取之后采用熒光PCR對TBDNA進行快速檢測。
本產(chǎn)品采用了Taqman熒光探針技術，其試劑比常規(guī)PCR試劑多了一個寡聚核苷酸探針，這個探針帶有一個熒光發(fā)光基團和一個熒光淬滅基團，完整的探針在特定光源激發(fā)下，發(fā)光基團所產(chǎn)生的熒光被淬滅基團全部吸收，樣品無熒光。PCR過程中，Taq酶在延伸DNA鏈的同時，可通過自身的5’→3’核酸外切酶活性降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使熒光報告基團與淬滅基團分離，分離后的熒光報告基團在特定光源激發(fā)下產(chǎn)生熒光。通過監(jiān)測整個PCR過程熒光信號的變化，對未知模板進行定性分析。
同時本產(chǎn)品采用內(nèi)標質(zhì)控體系，用于監(jiān)測反應體系可能存在的抑制因素。內(nèi)標質(zhì)控品與靶基因無同源性，內(nèi)標探針選擇的是與靶基因探針沒有沖突的另一檢測通道。
本試劑盒主要原材料包括：引物、探針、qPCRMasterMix、UDG酶、dUTP、TB菌液。其中引物、探針為申請人自行設計后由專業(yè)的合成公司合成，其他原材料均為外購方式獲得。申請人選擇有資質(zhì)的供應商提供的原料，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商，并制定了各主要原材料的質(zhì)量標準并經(jīng)檢驗合格。
企業(yè)參考品設置情況：申請人設計了完整的企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品。其中：
陽性參考品共15份，包括肺結(jié)核樣本、右側(cè)頸結(jié)核樣本、淋巴結(jié)核樣本、非洲分枝桿菌樣本、骨結(jié)核樣本、左肩結(jié)核樣本、腎結(jié)核樣本、腰椎結(jié)核樣本、左胸結(jié)核樣本、直腸結(jié)核樣本、胸壁結(jié)核樣本、BCG菌株和結(jié)核分枝桿菌菌株，濃度在1×103copies/mL～5×105copies/mL之間。
陰性參考品共15份，包括浸潤性腺癌樣本、肺癌樣本、慢性肺部炎癥樣本、間質(zhì)性肺炎樣本、肺鱗狀細胞癌樣本、人流感病毒A型菌株、人流感病毒B型菌株、膿腫分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、蘇加分枝桿菌和海分枝桿菌，其中菌株的濃度均為106CFU/mL。
最低檢出限參考品共8份，包括肺結(jié)核樣本、非洲分枝桿菌樣本、淋巴結(jié)核樣本、骨結(jié)核樣本、右頸結(jié)核樣本、腰椎結(jié)核樣本、BCG菌株和結(jié)核分枝桿菌菌株，濃度均為1×103copies/mL。
精密度參考品共2份，均為肺結(jié)核樣本，濃度分別為1×106copies/mL和1×104copies/mL。
申請人通過對試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。
申請人對反應體系中的TBPCR反應液、引物探針序列、引物探針濃度、樣本的上樣量、內(nèi)標體系和UDG酶體系的干擾、退火溫度、反應循環(huán)數(shù)等進行篩選和優(yōu)化，通過功能性試驗，最終確定了最佳反應體系。
該產(chǎn)品的分析性能包括核酸提取純化、準確性、精密度、最低檢出限、分析特異性（交叉反應和干擾試驗）、包容性、不同部位組織的評估等。申請人提交了有效運行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品在適用機型上的性能評估資料。
在核酸提取純化研究中，申請人采用臨床石蠟包埋組織樣本，平行比較了2種石蠟包埋組織核酸提取試劑盒的提取效果，根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究，確定了1種核酸提取試劑盒，與該產(chǎn)品配套使用。
在準確性研究中，申請人采用三批試劑盒檢測15份企業(yè)陽性參考品（1×103copies/mL～5×105copies/mL）和15份企業(yè)陰性參考品（其中菌株濃度為106CFU/mL），結(jié)果顯示：陽性符合率和陰性符合率均為100%。
在精密度研究中，申請人采用三批試劑盒，檢測陰性樣本(不含結(jié)核分枝桿菌復合群)、弱陽性樣本（濃度為2×103copies/mL）和中等陽性樣本（濃度為5×105copies/mL），分別評估了批內(nèi)、批間、日間、不同操作者之間以及不同實驗地點之間的精密度。結(jié)果顯示：檢測結(jié)果Ct值的CV值均小于5%，表明本產(chǎn)品的批內(nèi)、批間、日間、不同操作者間以及不同實驗地點間的重復性均符合要求。同時，對低濃度的石蠟包埋組織樣本進行提取精密度檢測，結(jié)果顯示：提取后臨床樣本的DNA濃度及純度差異較小，檢測結(jié)果Ct值的CV值均小于5%，說明石蠟包埋組織樣本經(jīng)多次提取的DNA質(zhì)量及檢測結(jié)果一致性符合要求。
在最低檢出限研究中，申請人將結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌石蠟樣本分別與陰性石蠟樣本混合，采用三批成品試劑盒檢測，最終確定并驗證了本試劑盒的最低檢出限為1×103copies/mL。
在交叉反應研究中，申請人采用三批試劑盒，對易產(chǎn)生交叉反應的病原體與可能引發(fā)臨床相似癥狀的病原菌進行了研究，包括19種非結(jié)核分枝桿菌復合群的其他分枝桿菌以及其他17種病原體。
本產(chǎn)品對以上36種病原菌的檢測結(jié)果全部為陰性。
在干擾試驗中，申請人對外源及內(nèi)源干擾物質(zhì)，肺癌樣本、肺部良性疾病樣本及肺部肉芽腫樣本進行了研究。
結(jié)果顯示：低于上述測試濃度的藥物不會對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。
對其他外源性干擾物質(zhì)10%福爾馬林（0.05v/v）、95%乙醇（0.05v/v）進行研究，同時對內(nèi)源性干擾物質(zhì)血紅素（0.02g/mL）、粘液（0.05v/v）、血紅蛋白（0.2g/mL）、人基因組（2.5μg/mL）進行研究，結(jié)果顯示：低于上述濃度的干擾物質(zhì)不會對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。
采用肺癌樣本、肺部良性疾病樣本及肺部肉芽腫樣本（共20余例）分別進行提取檢測，結(jié)果顯示：檢測結(jié)果全部為陰性，以上樣本類型不會干擾本試劑盒的檢測能力。
在包容性研究中，申請人采用三批試劑盒，檢測結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。結(jié)果顯示：本產(chǎn)品對結(jié)核分枝桿菌（濃度為103copies/mL）、牛結(jié)核分枝桿菌（濃度為1×103copies/mL）、非洲分枝桿菌（濃度為2×103copies/mL）和田鼠分枝桿菌（濃度為2×103copies/mL）均能100%檢出。
不同部位組織的評估：選擇不同部位的結(jié)核病組織樣本，包括睪丸結(jié)核、淋巴結(jié)核、腎結(jié)核、手指結(jié)核、胸壁結(jié)核、胸腔結(jié)核、胸椎結(jié)核、腰椎結(jié)核、右頸結(jié)核、右膝結(jié)核、直腸結(jié)核、左頸結(jié)核、左胸結(jié)核、左腰結(jié)核，提取核酸后，采用陰性樣本稀釋至最低檢出限，用三批試劑分別對其檢測20次，檢測結(jié)果均為陽性，與測序結(jié)果一致。
（四）陽性判斷值
申請人采用ROC曲線法確定陽性判斷值。申請人采用本產(chǎn)品對237例臨床石蠟包埋組織樣本（178個結(jié)核分枝桿菌復合群陽性樣本和59個結(jié)核分枝桿菌復合群陰性樣本）進行檢測，結(jié)果顯示：當靶基因通道Ct值為37左右時，本產(chǎn)品的靈敏度和特異性達到最佳。所以確定本產(chǎn)品的陽性判斷值為37，并確定以下判讀方法：
注：高濃度樣本(Ct值≤15)，由于競爭抑制，內(nèi)標通道無S型擴增曲線屬于正常情況，建議標本進行梯度稀釋后進行檢測。
申請人采用申報產(chǎn)品對17例灰區(qū)樣本進行復檢驗證，結(jié)果顯示：復檢后的結(jié)果與測序驗證的結(jié)果一致性可達到90%以上。
（五）穩(wěn)定性研究
申請人對本產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、開瓶及凍融穩(wěn)定性等進行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品的有效保存時間。同時，對石蠟包埋組織樣本的常溫放置穩(wěn)定性、石蠟包埋組織提取的DNA冷凍穩(wěn)定性進行了研究，確定了臨床樣本的有效保存時間。
實時穩(wěn)定性研究：將三批儲存于-20±5℃條件下的申報產(chǎn)品經(jīng)過長途高溫運輸后寄回，分別在申報產(chǎn)品生產(chǎn)后的第0、4、8、12、14個月檢測企業(yè)參考品，結(jié)果顯示：在上述各時間點檢測企業(yè)參考品的各項性能指標均符合要求。因此確定申報產(chǎn)品的效期穩(wěn)定性為：-20±5℃避光保存，有效期12個月。
三、臨床評價概述
申請人在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院和武漢市肺科醫(yī)院共3家臨床試驗機構(gòu)完成了臨床試驗。采用試驗用體外診斷試劑與Sanger測序法及病理診斷結(jié)果進行比較研究的方法，對產(chǎn)品臨床性能進行評價。入組病例包括肺結(jié)核、肺外結(jié)核以及肺癌、非結(jié)核分枝桿菌感染、真菌感染等其他易混淆疾病患者，樣本類型為石蠟包埋組織樣本。臨床試驗共入組受試者604例，其中陽性樣本400例，陰性樣本204例。試驗結(jié)果顯示，申報產(chǎn)品與Sanger測序檢測陽性符合率為99.25%（95%CI：97.82%，99.85%），陰性符合率為95.59%（95%CI：91.79%，97.96%）；與病理診斷對比，靈敏度為92.78%（95%CI：89.07%，95.53%），特異度為96.39%（95%CI：89.80%，99.25%）。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗設計符合《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的相關要求，臨床試驗結(jié)果顯示該產(chǎn)品與對比方法一致性較好，臨床性能滿足臨床需求。
四、產(chǎn)品受益風險判定
根據(jù)申請人提供的申報資料，經(jīng)綜合評價，在目前認知水平上，認為該產(chǎn)品能夠較大程度地滿足醫(yī)療需求，預期為適用人群帶來的受益大于風險。但為保證用械安全,基于對主要剩余風險的規(guī)避，需在說明書中提示以下信息：
該產(chǎn)品檢測結(jié)果應結(jié)合患者臨床癥狀、體征、流行病學背景及其他臨床診斷結(jié)果進行綜合判斷，不得作為疾病診斷的唯一標準。
綜合評價意見
本申報項目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊，屬于境內(nèi)同品種首個產(chǎn)品。申請人的注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務院令第680號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令2014年第5號）等相關醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。
